Потенциальный репеллент против бури ягоды кофе (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae)

1. Аннотация Устройство для сбора кофейных ягод Hypothenemus hampei (Ferrari) по-прежнему представляет...
2. Летучий сбор и идентификация
3. приборостроение
4. химикалии
5. электрофизиологии
6. Лабораторные биоанализы
7. Полевой Эксперимент
8. Статистический анализ
9. Результаты
10. электрофизиологии
11. Лабораторные биоанализы
12. Таблица 1.
13. Полевой Эксперимент
14. Таблица 2.
15. обсуждение

Аннотация

Устройство для сбора кофейных ягод Hypothenemus hampei (Ferrari) по-прежнему представляет собой серьезную проблему для производителей кофе по всему миру. Из-за загадочной жизненной привычки насекомого в кофейных ягодах было трудно разработать эффективные стратегии борьбы с вредителями. Сесквитерпен, ( E , E ) -α-фарнезен, полученный из зараженных кофейных ягод, был идентифицирован как потенциальный репеллент против бурильщика кофейных ягод как в лабораторных биологических анализах, так и в полевых экспериментах на Гавайях. Различные лабораторные биоанализы выявили значительно более низкие уровни заражения у ягод, обработанных различными концентрациями ( E , E ) -α-фарнезена. В результате полевого эксперимента на Гавайях до 80% уменьшилось улавливание кофейных ягод в ловушках, содержащих стандартный аттрактант метанол: этанол 3: 1 и композицию ( E , E ) -α-фарнезена с пузырьковой крышкой по сравнению с ловушками с одним только аттрактантом , ( E , E ) -α-фарнезен все еще оставался активным через 19 недель после установки на кофейной плантации, основываясь на 59% меньшем захвате насекомых в ловушках, содержащих аттрактант + ( E , E ) -α-фарнезен (1737 насекомых) по сравнению с ловушками содержащий аттрактант (4253 насекомых). Простота установки пузырьковых крышек - это приятный контраст с другими стратегиями борьбы с вредителями, которые требуют распыления. Размещение ( E, E ) -α-фарнезена в пузырьковых крышках на кофейных плантациях, когда кофейные ягоды впервые становятся восприимчивыми к заражениям (примерно через 90 дней после цветения), может привести к снижению уровня заражения в течение сезона и, следовательно, к повышению урожайности и прибыль.

Ключевые слова: короеды, broca del café, ( E, E ) -α-фарнезен, управление бурильщиком кофейных ягод, push-pull

Наиболее экономически важным насекомым-вредителем, влияющим на производство кофе ( Coffea arabica и Coffee canephora ) во всем мире, является возбудитель кофейных ягод Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) ( Вега и соавт. 2015 ). Взрослые самки имеют отверстие в диске кофейной ягоды (то есть круглую область в нижнем конце ягоды, напротив цветоножки) и откладывают яйца в галереях, построенных по всему эндосперму, где личинки и взрослые питаются кофейным зерном. , Большая часть жизненного цикла насекомых проходит внутри кофейных ягод, что делает его довольно сложным для контроля как химическими, так и нехимическими методами. Ежегодные ежегодные убытки, вызванные возбудителем кофейных ягод в Бразилии, оцениваются в 215–358 млн. Долл. США в год ( Оливейра и соавт. 2013 ), предполагая, что ежегодные убытки, наносимые насекомым во всем мире, должны легко превысить 500 миллионов долларов.

Хотя, по крайней мере, почти два десятка исследований изучали сигналы, используемые бурильщиком кофейной ягоды для локализации ягоды ( Пратес 1969 ; Эскинка Авилес, 1986 ; Гутьеррес-Мартинес и соавт. 1990 ; Матье и соавт. 1991 ; Мендоса-Мора 1991 ; Джорданенго и соавт. 1993 ; Гутьеррес-Мартинес и Вирхен Санчес 1995 ; Гутьеррес-Мартинес и Ондарза 1996 ; Матье и соавт. 1996 ; Брун и Матье 1997 ; Веласко Паскуаль и соавт. 1997a , б ; Матье и соавт. 1998 , 1999 ; Борбон Мартинес и др. 2000 ; Карденас 2000 ; Матье и соавт. 2001 ; Сараванан и Чожан 2003 ; Ортиз и соавт. 2004 ; Рохас 2005 ; Дюфур и Фреро 2008 ; Mendesil et al. 2009 ; Jaramillo et al. 2013 ; Njihia и соавт. 2014 ), исследования, включающие репелленты для ягодных кофейных ягод, остаются в значительной степени недоисследованными, и всего лишь несколько исследований. Например, Борбон Мартинес и др. (2000) сообщалось о различных летучих веществах из зеленых листьев, которые снижали улавливание уловителя кофейных ягод по сравнению со смесью метанол: этанол 3: 1, используемой в качестве аттрактанта. В лабораторном исследовании, Матье и соавт. (2001) обнаружили, что девственные и спарившиеся самки неродившиеся были отталкиваться от неопознанных летучих веществ из красных кофейных ягод. Гонгора и соавт. (2012) идентифицировал изопрен как возможный отталкивающий агент для ягод кофе. В заключение, Njihia и соавт. (2014) идентифицировал брокаин (1,6-диоксаспиро [4,5] декан) в качестве аттрактанта в низких дозах и в качестве репеллента в высоких дозах (> 160 нг / мкл); Фронталин (1,5-диметил-6,8-диоксабицикло [3.2.1] октан) также оказывает репеллентное действие (> 40 нг / мкл).

Вега и соавт. (2011) сообщили, что увеличение плотности женских ягодок кофе в искусственном рационе (то есть, при неограниченных пищевых ресурсах) привело к снижению плодовитости и выдвинули гипотезу о том, что возможным механизмом такого снижения плодовитости может быть производство летучих веществ, которые действуют как маркировка хозяина феромоны, антиагрегационные феромоны или химические вещества для сдерживания яйцеклетки, которые могут служить репеллентами. Такие летучие вещества могут снизить внутривидовую конкуренцию, как сообщалось для многих насекомых ( Вега и соавт. 2011 ). На основании этих результатов было проведено несколько экспериментов, чтобы выяснить, продуцировали ли кофейные ягоды, зараженные отверстием кофейных ягод, репеллентные соединения, что привело к идентификации сесквитерпена, ( E, E ) -α-фарнезена, как потенциального репеллента в лаборатории и полевые испытания.

Материалы и методы

Кофейные ягоды и кофейные ягодники

Зараженные ягоды кофе и зараженные ягоды кофе ( C. arabica ) собирали на кофейных плантациях в Коне, Гавайи и отправляли в лаборатории ARS в Пеории (Иллинойс) и Белтсвилле (Мэриленд). Взрослая самка с ягодами кофе, выращенными на искусственной диете ( Вега и соавт. 2011 ) были использованы в лабораторных биопробах. Возраст взрослых самок не контролировался на протяжении всего эксперимента.

Летучий сбор и идентификация

Первая идентификация летучих веществ была основана на помещении одной кофейной ягоды, наполненной зеленым полем, в стеклянный флакон с крышкой. Летучие вещества в свободном пространстве собирали, помещая твердофазную иглу для микроэкстракции (SPME, 100-мкм полидиметилсилоксановое волокно) (Supelco, Inc., Bellefonte, Pennsylvania) на 1–2 мм выше отверстия, пробуренного насекомым, для проникновения в ягоду. Иглу также помещали в непосредственной близости от искусственно скучающей неопыленной ягоды в стеклянном флаконе. Через 1 час сбора иглу отводили и анализировали методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Эксперимент имел пять повторностей.

В последующем эксперименте 10 зараженных ягод и 10 неопитанных ягод зеленого кофе помещали в стеклянные колбы на 100 мл для сбора летучих веществ (по пять повторов в каждой). Колбы для сбора были подсоединены к адаптерам для стеклянных термометров (штыревое соединение 24/40, Ace Glass, Vineland, NJ). Адаптеры имели тефлоновые фитинги на каждом конце для удерживания летучего фильтра-ловушки (внутренний диаметр 6 × 0,4 см), содержащего 100 мг HayeSep-Q (Restek, Bellefonte, PA) и через который воздух (50 мл / мин) всасывался в вакууме. Входной фильтр очищал поступающий воздух, а второй фильтр улавливал летучие вещества, испускаемые внутри колб. Продолжительность сбора была непрерывной в течение 4 дней, и собранные летучие вещества извлекали путем промывки выходного фильтра HayeSep-Q с 400 мкл петролейного эфира во флакон. Колбы для сбора хранили в инкубаторе при 27 ° С с относительной влажностью около 50%. Свет обеспечивался восемью флуоресцентными трубками мощностью 40 Вт, установленными примерно на 0,5 м выше и позади колб для сбора, и дневной световой цикл составлял фотопериод L: D h 17: 7.

приборостроение

Летучие коллекции анализировали с помощью ГХ с пламенно-ионизационным детектированием (FID) и связанной ГХ-МС. Образцы вводили в режиме без разделения, используя Hewlett Packard 6890 GC, подключенный к масс-селективному детектору Hewlett Packard 5973 (электронное воздействие, 70 эВ). Для большинства анализов использовали 30-метровую капиллярную колонку DB-5 (внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, J & W Scientific, Folsom, CA). Температурная программа составляла 50 ° C в течение 1 минуты, затем повышалась до 280 ° C со скоростью 10 ° C в минуту и ​​выдерживалась в течение 5 минут при 280 ° C. Температура на входе составляла 250 ° С, а температура линии передачи составляла 280 ° С. Библиотека Wiley MS ( Wiley 2005 ) был установлен в системе данных. Во всех анализах ГХ использовали He в качестве газа-носителя при постоянном давлении (41,4 кПа).

химикалии

( E, E ) -α-фарнезен очищали (чистота 90%) из смеси изомеров фарнезена (Bedoukian Research, Danbury, CT; код продукта 808) препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Система состояла из насоса Waters M6000, дифференциального рефрактометра Waters R401 и колонки, обработанной AgNO3. Колонку AgNO3 готовили из колонки с силикагелем с внутренним диаметром 25 см × 4,6 мм (Alltech, Адсорбосфера, 5 мкм) по методу Хит и Сонет (1980) , Элюирующим растворителем был 5% эфир в гексане. Идентификация ( E, E ) -α-фарнезена была подтверждена аутентифицированным образцом натурального ( E, E ) -α-фарнезена (чистота 70%, Contech Enterprises Inc., Виктория, Британская Колумбия, Канада). Образец Contech содержал приблизительно 18% дополнительного неопознанного изомера фарнезена. В первых трех экспериментах по биоанализу использовался материал, очищенный ВЭЖХ. Образец (5R, 7S) -конофторина, используемый в качестве положительного контроля GC-EAD ( Jaramillo et al. 2013 ), было получено от Synergy Semiochemicals Corp. (Бернаби, Канада). ( E, E ) -α-фарнезен (чистота 70%) для полевых рецептур из пузырьковой кабины был получен из Bedoukian Research (Danbury, CT).

электрофизиологии

Связанные ГХ-электроантеннографические обнаружения (GC-EAD) были сделаны методами и оборудованием, обычно описываемым Коссе и Бартельт (2000) , Соединения GC-EAD были сделаны путем вставки серебряно-заземляющего электрода со стеклянной пипеткой (WPI Inc., Сарасота, Флорида) в заднюю часть вырезанной головки женского жука. Второй серебряно-заземленный зонд со стеклянной пипеткой пробил кончик одной из усиков. Оба электрода были заполнены физиологическим раствором Бидл-Эфрусси ( Эфрусси и Бидл 1936 ). Электроды устанавливали на место с помощью пьезоприводных микроманипуляторов (Sensapex, Oulu, Finland). Записывающий электрод был подключен к предусилителю с батарейным питанием (Iso-Dam, WPI Inc., Сарасота, Флорида), который подключался к усилителю AC / DC UN-06 (Syntech, Hilversum, Нидерланды). Сбор и анализ ответов выполнялись компьютером, оснащенным платой аналого-цифрового преобразования (IDAC-2, Syntech), на которой установлено программное обеспечение GC-EAD (Syntech). Приблизительно 25 нг / соединение продували через антенну препарата путем инъекции 100 нг образцов (раствор в петролейном эфире) из смеси стандартных соединений, содержащих (5R, 7S) конофторин и ( E, E ) -α-фарнезен (70%). чистый, Contech, 1: 1, без расщепления) с приблизительно 50% продувкой по всей антенне (FID: EAD: расщепление 1: 1). GC-EAD проводили с использованием 15-метровой капиллярной колонки DB-5 (внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 1,0 мкм, J & W Scientific, Folsom, CA). Более тонкая пленка и более короткая длина колонки по сравнению с колонкой GC-MS позволили сократить время элюирования, что соответствовало иногда короткому сроку службы антенны. Температурная программа составляла 50 ° C в течение 1 минуты, затем повышалась до 280 ° C со скоростью 25 ° C в минуту и ​​выдерживалась в течение 5 минут при 280 ° C. Температура на входе составляла 250 ° С, а температура линии передачи составляла 280 ° С.

Лабораторные биоанализы

Биоанализ проводили с ( E, E ) -α-фарнезеном в четырех концентрациях: 0,4, 4, 40 и 80 мкг / мкл. Для каждой из этих концентраций мы наносили 2,5 мкл на оба конца зеленой кофейной ягоды (то есть на ножку и диск), чтобы получить диапазон 1, 10, 100 и 200 мкг на каждом конце кофейной ягоды. Для контроля мы использовали петролейный эфир, который был растворителем, использованным для приготовления четырех концентраций ( E, E ) -α-фарнезена. Все эксперименты проводились в сцинтилляционных флаконах, содержащих небольшой слой пластыря Парижа для поглощения избыточной влаги. Камера роста Percival Scientific E-36L (Percival Scientific Inc., Perry, IA) хранилась в темноте и была установлена ​​на 25 ° C и использовалась во всех биоанализах.

Два предварительных биоанализа были проведены для оценки возможного репеллентного эффекта. В первом из них мы сравнивали 40 мкг / мкл ( E, E ) -α-фарнезена с контролем. Одна ягода была помещена в каждый сцинтилляционный флакон сразу же после применения обработок, и один флакон для взрослых ягодок кофе был введен во флакон. Всего было 20 повторов. Процент скучающих ягод определяли через 1 и 17 ч после применения. Во втором предварительном биоанализе мы сравнили 0,4, 4 и 40 мкг / мкл ( E, E ) -α-фарнезена с контролем, используя метод, описанный выше. Было 20 повторов (ягод) для каждой концентрации ( E, E ) -α-фарнезена и 19 для контроля. Процент ягод, укорененных насекомым, определяли через 1 и 24 ч после нанесения.

В третьем биоанализе процент скучающих ягод определяли с использованием 4 и 40 мкг / мкл ( E , E ) -α-фарнезена и сравнивали с контролем. Прогон в разное время в течение четырех дат, в общей сложности было 50 ягод (то есть повторов) для контроля, 87 для низкой ( E , E ) -α-фарнезена и 15 для высокой концентрации. Одна ягода была помещена в каждый сцинтилляционный флакон сразу же после применения обработок, и один флакон для взрослых ягодок кофе был введен во флакон. Количество ягод, которым было скучно насекомое, оценивали через 1 и 24 часа после нанесения.

Последующие биоанализы проводили с использованием ( E , E ) -α-фарнезена, приобретенного у Contech. Мы определили процент кофейных ягод, утомленных насекомым, после применения 40 или 80 мкг / мкл ( E , E ) -α-фарнезена по сравнению с контролем. Более высокая концентрация была включена для определения реакции насекомых на удвоенную предыдущую наибольшую испытанную дозу. Мы проводили три биоанализа в день, каждый из которых состоял из трех повторений по 10 повторов в каждом для трех обработок (контроль, 40, 80 мкг / мкл), всего 30 насекомых на обработку в день. Биотесты были повторены в три разные даты для общего количества 90 насекомых на обработку. Одна ягода была помещена в каждый сцинтилляционный флакон сразу же после применения обработок, и один флакон для взрослых ягодок кофе был введен во флакон. Мы определили процент ягод, которым было скучно насекомое через 1 и 24 часа после нанесения.

Выборочные биотесты проводились для проверки влияния более высокой дозы (80 мкг / мкл) с использованием трех сцинтилляционных флаконов, соединенных стеклянными пробирками (). Одна взрослая особь женского пола с кофейной ягодой была выпущена на центральную арену и имела возможность выбрать ягоду, обработанную 80 мкг / мкл ( E , E ) -α-фарнезена или необработанную ягоду. Как только насекомые были выпущены, флаконы были закрыты. Мы повторили эксперименты шесть раз, с четырьмя повторениями, состоящими из 10 тестов биоанализа с индивидуальным выбором, одним повторением, состоящим из 20, и одним повторением, состоящим из девяти ( n = 69). Процент ягод, которым было скучно насекомое, оценивали через 1 и 24 часа после нанесения.

Выбор установки биоанализа с использованием трех сцинтилляционных флаконов, соединенных стеклянными пробирками. Отверстия были сделаны в сцинтилляционных флаконах с алмазным сверлом DeWalt 6,4 мм. Одна взрослая самка была освобождена на центральной арене и имела возможность выбрать контрольную ягоду или ягоду, обработанную 80 мкг / мкл ( E , E ) -α-фарнезена.

Полевой Эксперимент

Полевой эксперимент был проведен на плантации C. arabica (сортовой тип), растущей на полном солнце в Пахала, Гавайи (плантация Cloud Rest; 19 ° 11–54,02 ″ с.ш .; 155 ° 31–17,53 ″ в.д .; 1720 м над уровнем моря; ) с ок. 65% заражения ягодного кофе. Образцы (2 мл) ( E , E ) -α-фарнезена (Bedoukian Research, Danbury, CT) готовили (Synergy Semiochemicals Corp., Burnaby, Canada) в полиэтиленовые пузырьковые крышки диаметром 29 мм, глубиной 10 мм. Исследования элюции, проведенные Synergy Semiochemicals Corp. в камере старения при постоянной температуре 25 ° C, показали, что ( E , E ) -α-фарнезен элюируется в дозе 5–25 мг в день в течение 90-дневного периода.

Google Maps вид на кофейную плантацию Cloud Rest в Пахала, Гавайи, где проводился полевой эксперимент. Каждый красный квадрат указывает на расположение ловушек ( n = 12 / трт).

Коммерчески доступные ловушки для кофейных ягод (BROCAP®, Agroindustrias Unidas de México, México;) были подвешены приблизительно. Высота 1,2 м (4ʹ) от кофейной ветви, с 12 повторами для каждой из двух обработок: (1) ловушки, содержащие стандартный аттрактант метанол: этанол в соотношении 3: 1 ( Мендоса Мора 1991 , Вега и соавт. 2015 ); и (2) ловушки, содержащие как аттрактант, так и состав ( E , E ) -α-фарнезеновой пузырьковой крышки. Экспериментальный дизайн был парным t- тестом. показывает конструкцию ловушки с дозатором аттрактанта непосредственно над воронкой и крышкой с пузырьками в верхней левой части (белый пластик). показывает крупным планом пузырьковую шапку. Пойманные в ловушку жуки были собраны в мыльной воде. Дозатор метанол: этанол и улавливающий раствор пополняли по мере необходимости. Ловушки были расположены на расстоянии 20 м друг от друга (). Количество насекомых, пойманных в каждой ловушке, определяли каждую неделю в течение 19 недель.

(A) Ловушка BROCAP®, содержащая стандартный метанол: этанольный аттрактант в соотношении 3: 1 и ( E, E ) -α-фарнезеновую пузырьковую крышку. Диспенсер для аттрактанта находится непосредственно над воронкой, а в верхней левой части видна пузырьковая крышка (белый пластик). (B) Крупным планом пузырчатой ​​шапки.

Статистический анализ

Результаты были проанализированы с использованием Student T- TEST в Excel (Microsoft, Inc, Bellevue, WA), чтобы определить значимость разницы средних. Во всех тестах предполагалось двустороннее распределение. Во всем, кроме последнего эксперимента (полевые исследования), допускалась одинаковая дисперсия. Для полевого исследования, которое было разработано как парный t- тест (дизайн, обычно используемый для этих типов полевых исследований), был использован парный t- тест. Этот анализ также был уместным, потому что количество жуков, пойманных за одну неделю, варьировалось на порядок. Результаты t- теста отображаются как вероятность того, что средние значения для двух групп населения были равны. Таким образом, вероятность 0,05 означает, что средние значения не равны при уровне достоверности 95%.

Результаты

Летучий сбор и идентификация

ГХ-МС сравнения профилей летучих веществ SPME показали, что четыре соединения в одиночных ягодах, зараженных кофейными ягодами, но не в контрольных ягодах (отмечены звездочкой;). Эти соединения (MW 204) были предварительно идентифицированы как сесквитерпены масс-спектральной библиотекой. Один из сесквитерпенов был предварительно идентифицирован как ( E , E ) -α-фарнезен. Время удерживания ГХ (14,84 мин) и масс-спектр этого сесквитерпена соответствуют спектрам очищенного ВЭЖХ ( E , E ) -α-фарнезена и ( E , E ) -α-фарнезена, полученных из Contech. Соотношения соединений этих четырех сесквитерпенов были переменными, но ( E , E ) -α-фарнезен был основным компонентом во всех пяти повторностях. Помимо количественных различий, было очень мало качественных различий в собранных летучих веществах HayeSep-Q между 10 зараженными и 10 не зараженными ягодами, но в зараженной пробе были обнаружены намеки на более ранние представляющие интерес соединения SPME (). В отличие от коллекций SPME, эти динамические летучие вещества, собранные HaySep-Q, были собраны из всей ягоды и, таким образом, показали относительное содержание соединений по сравнению со статическими и сфокусированными коллекциями SPME. Эти дополнительные соединения мешали попыткам очистки (ВЭЖХ и ЖХ) представляющих интерес сесквитерпенов, и из-за очень небольших количеств (пикограмм) сесквитерпенов, присутствующих в образцах SPME образцов зараженных ягод, и очень похожих масс-спектров, дальнейшие попытки не предпринимались определить оставшиеся три сесквитерпена, представляющих интерес.

Статическая твердофазная микроэкстракция (SPME) - сбор летучих веществ в свободном пространстве из одной ягоды кофе, зараженной бореркой, и не зараженной ягоды кофе. ( E , E ) -α-фарнезен элюируется через 14,84 мин.

электрофизиологии

Анализ GC-EAD для смеси стандартных соединений показан в. Ответы были переменными из-за различий в антеннальных препаратах; однако, усики женского кофейного ягодника дали положительный ответ EAD на ( E, E ) -α-фарнезен ( b ) и неидентифицированный изомер фарнезен ( c ), а также на положительный (5R, 7S) -конофторин ( a ) контроль. Из-за очень небольшого количества собранных летучих веществ не было зарегистрировано ни одного успешного ответа GC-EAD с собранными летучими веществами SPME, и только стандартные образцы использовались для определения антеннальной активности.

Одновременно регистрируют газовую хроматограмму (детектор ионизации пламени [FID]) и электроантенограмму (EAD) от антенны для бурения кофейных ягод, реагирующую (٭) на стандартные образцы (5R, 7S) -конофторина ( a ), ( E , E ) -α -farnesene ( b ) и неопознанный изомер фарнезена ( c ).

Три дополнительных неопознанных сесквитерпена могут быть поведенчески активными соединениями; однако эти соединения также будут присутствовать в контрольных ловушках, потому что весь кофейный сад был заражен жуками. Обнаруженный E, E- фарнезен, по-видимому, локализован в скучном отверстии зараженной ягоды и реже в зараженной ягоде в целом, хотя это не было полностью изучено в этом исследовании. В более естественных обстоятельствах E, E -фарнезен может удерживать дополнительных жуков, скучных в уже зараженную ягоду при концентрациях E, E- фарнезена, которые намного ниже, чем используемые в этом исследовании. Тем не менее, в этом исследовании концентрации E , E- фарнезена, использованные в биоанализах и полевых экспериментах, по-прежнему удерживали жуков за счет отложенного бурения ягод в биоанализах и более низких уловленных ловушек в поле, что указывает на аналогичные сдерживающие эффекты при более высоких концентрациях. Неидентифицированный EAD-активный E , E -фарнезеновый изомер в образцах Contech не присутствовал в E , E -фарнезене, поставляемом Bedoukian для формирования полевой пузырьковой шапки, и, таким образом, не был бы частью наблюдаемой полевой поведенческой активности.

Лабораторные биоанализы

Два предварительных биоанализа показали меньший процент скучных кофейных ягод после применения. Через один час после нанесения 40 мкг / мкл ( E , E ) -α-фарнезена на оба конца кофейных ягод 55% ягод в контроле были наскучены насекомыми в отличие от 10% в обработанных ягодах ( n = 20 / TRT). Через 17 ч после инициации 65% ягод в контроле было скучно против 10% у обработанных ягод. Во втором предварительном биоанализе применение ( E , E ) -α-фарнезена в дозах 0,4, 4 и 40 мкг / мкл привело к 70%, 30% и 5% скучающим ягодам через 1 ч после применения, соответственно, по сравнению с 89,5 % в контроле и 75%, 30%, 25% утомленных ягод через 24 часа после применения, соответственно, по сравнению с 95% в контроле.

В третьем биоанализе процент скучающих ягод определяли с использованием 4 и 40 мкг / мкл ( E , E ) -α-фарнезена и сравнивали с контролем. Средство через 1 и 24 ч после применения для контроля (63% и 94% соответственно) и для 4 мкг / мкл ( E , E ) -α-фарнезена (16% и 89% соответственно) значительно различалось на Уровень достоверности 95% ( P = 0,007, P = <0,001 соответственно), что свидетельствует о том, что с увеличением времени от 1 до 24 ч процент скучающих ягод значительно увеличился. Через 1 час после нанесения также были достоверные различия при уровне достоверности 95% между контролем и 4 мкг / мкл (63% против 16% соответственно; P = <0,001), что указывает на первоначальный сильный отталкивающий эффект. Этот эффект исчезает через 24 часа, когда среднее сравнение между контролем и 4 мкг / мкл не обнаруживает значимых различий (94% против 89% соответственно; P = 0,264). Было недостаточно точек сбора данных при 40 мкг / мкл для проведения достоверного статистического анализа.

Результаты трех отдельных биоанализов в день, повторенные в течение 3 дней с использованием Contech Enterprises ( E , E ) -α-фарнезен, показали, что это означает, что 1 контрольная проба через 24 часа после применения (82% против 91%), 40 мкг / мкл (52% против 79%) и 80 мкг / мкл (26% против 43%) значительно различались при уровне достоверности 95% ( P = 0,048, P = 0,004, P = 0,014 соответственно), что указывает на то, что с увеличением времени с 1 до 24 ч процент скучающих ягод значительно увеличился. Через 1 ч после применения также были достоверные различия при уровне достоверности 95% между контролем и 40 мкг / мкл (82% против 52% соответственно; P = <0,001) и между контролем и 80 мкг / мкл. (82% против 26% соответственно; P = <0,001). Через 24 ч после применения были достоверные различия при уровне достоверности 90% между контролем и 40 мкг / мкл (91% против 79% соответственно; P = 0,093) и значительные различия при уровне достоверности 95% между контролем и 80 мкг / мкл (91% против 43% соответственно; P = <0,001).

Результаты экспериментов по выбору биоанализа () показали, что через 1 ч после применения не было значимых различий между (а) количеством насекомых в контроле по сравнению с центральной ареной ( P = 0,539), центральной ареной и 80 мкг / мкл. ( E , E ) -α-фарнезен ( P = 0,255) или контроль по сравнению с 80 мкг / мкл ( P = 0,390). В отличие от этого, через 24 ч после применения наблюдались значительные различия в (a) количестве насекомых в контроле по сравнению с центральной ареной ( P = 0,008) и в контроле по сравнению с 80 мкг / мкл ( P = 0,02; парные t - тесты), в то время как не было никаких существенных различий в центральной арене против 80 мкг / мкл ( P = 0,967). Через один час после применения были значимые различия ( P = 0,028) в проценте скучающих ягод в контроле (16%) по сравнению с обработанными ягодами (0%), и через 24 часа после применения разница была очень высокой значительный ( P = <0,001), с 45% контрольных ягод скучно в отличие от 9% у обработанных ягод ().

Таблица 1.

Результаты выбора биоанализа с использованием трех сцинтилляционных флаконов, соединенных стеклянными пробирками (). В). Взрослые самки были освобождены на центральной арене (в центре) и имели возможность перейти к контрольной ягоде или к ягоде, обработанной 80 мкг / мкл ( E , E ) -α-фарнезена. Процент ягод, которым было скучно насекомое, оценивали через 1 и 24 часа после нанесения

Повторение 1 ч (ягоды скучают в скобках) 24 ч (ягоды скучают в скобках) n Контрольный центр 80 мкг / мкл Контрольный центр 80 мкг / мкл 1 3 (0) 4 3 (0) 3 (3) 4 3 (2) 10 2 2 (0) 8 0 (0) 7 (6) 3 0 (0) 10 3 3 (2) 2 4 (0) 4 (3) 1 4 (2) 9 4 4 (3) 5 1 (0) 6 (5) 2 2 (0) 10 5 3 (2) 2 5 (0) 4 (4) 2 4 (1) 10 6 10 (5) 6 4 (0) 11 (11) 6 3 (0) 20 Всего 25 (12) 27 17 (0) 35 (32) 18 16 (5) 69% насекомых на каждой арене 34% 40% 26% 50% 25% 25% - P 0,539 (контроль против центра) 0,008 (контроль против центра ) - 0,255 (центр против 80 мкг / мкл) 0,967 (центр против 80 мкг / мкл) - 0,390 (контроль против 80 мкг / мкл) 0,020 (контроль против 80 мкг / мкл) -% скучающих ягод 16% - 0% 45% - 9% - P 0,028 (контроль против 80 мкг / мкл) <0,000 (контроль против 80 мкг / мкл) -

Полевой Эксперимент

Всего за 19 недель было поймано 58 018 возбудителей кофейных ягод. Среднее значение ± SD для еженедельных захватов составило 2,208 ± 1,556 в ловушках с аттрактантом в отличие от 846 ± 791 в ловушках, содержащих как аттрактант, так и ( E , E ) -α-фарнезен. Эти различия были очень значительными ( P = <0,001; парные t- тесты). В двух случаях уловы были на 80 и 81% ниже () в ловушках с аттрактантом и ( E , E ) -α-фарнезеном. За период выборки в 19 недель ловушки с аттрактантом и ( E , E ) -α-фарнезеном имели на 62% более низкое улавливание (16 073 насекомых), чем ловушки, содержащие только аттрактант (41 945 насекомых). Пузырьковые колпачки, установленные 18 августа 2014 года, никогда не заменялись, поэтому они оставались в силе не менее 19 недель ().

Таблица 2.

Еженедельные захваты ягоды кофе в эксперименте, проводимом на заброшенной кофейной плантации, растущей на полном солнце в Пахале, Гавайи (). Насекомых ловили в ловушках BROCAP® с аттрактантом и в ловушках, сочетающих аттрактант и ( E , E ) -α-фарнезен (). В)

Неделя № Дата выборки (2014) Аттрактант Аттрактант + ( E , E ) -α-farnesene Всего% Сокращение 1 25 августа 3,408 690 4,098 80% 2 1 сентября 2,802 750 3,552 73% 3 8 сентября 1 097 467 1,764 64% 4 15 сентября 786 191 977 76% 5 22 сентября 1,323 376 1,699 72% 6 29 сентября 856 289 1,145 66% 7 6 окт 646 295 941 54% 8 13 окт 906 343 1,249 62% 9 20 окт 961 405 1,366 58% 10 27 окт 1,233 749 1,982 40% 11 3 ноября 1,024 559 1,583 45% 12 10 ноября 3,688 1,817 5,505 51% 13 17 ноября 2,827 1,049 3,876 63% 14 24 ноября 2,238 428 2,666 81% 15 1 дек 3,888 1,017 4,905 74% 16 8 дек 1 154 547 1,701 53% 17 15 Дек 6,404 3,529 9,933 45% 18 22 дек 2,251 835 3,086 63% 19 29 дек 4,253 1,737 5,990 59% ИТОГО 41,945 16,073 - 62%> Среднее ± SD 2,208 ± 1,556 846 ± 791 3,054 ± 2,294 - P = <0,001 - -

обсуждение

Несколько разнообразных ролей для ( E , E ) -α-фарнезена были обнаружены в природе. Например, ( E , E ) -α-фарнезен был идентифицирован в естественном восковом покрытии яблок ( Хуэлин и Мюррей 1966 ); в качестве аттрактанта и стимулятора яйцекладки для Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae; Ношение и Хатчинс 1973 , Сазерленд и соавт. 1977 ); в качестве сигнального феромона для каналифронов Prorhinotermes (Isoptera: Rhinotermitidae; Шоботник и соавт. 2008 ); в качестве возможного репеллента против Pityophthorus pubescens (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae; Лопес и соавт. 2013 ); и как компонент феромона Anoplophora glabripennis (Coleoptera: Cerambycidae; Crook et al. 2014 ), среди прочих.

( E , E ) -α-фарнезен является летучим сесквитерпеном с двумя сопряженными двойными связями. Эти реактивные молекулы чувствительны к инактивации путем фотохимического и воздушного окисления ( Анет 1969 , Spicer et al. 1993 ). Для продолжительного долговечности в полевых условиях он должен быть защищен от деградации. В большинстве районов выращивания кофе часто бывают дожди и периоды интенсивного солнечного света, что исключает использование ( E, E ) -α-фарнезена в качестве прямого опрыскивания листвы. Кроме того, фарнезен также может вызывать фитотоксичность ( Джу и Карри 2000 ; Araniti et al. 2013 , 2016 ), еще одна причина его непригодности в качестве лиственного опрыскивания. Пассивные энергозависимые системы доставки регулируются законом диффузии Фика ( Фик 1855 , Филиберт 2005 ), и очень маленькие резервуары, такие как микрокапсулы, имеют ограниченную способность поддерживать доставку летучих веществ в течение длительных периодов времени. Микрокапсулирование также является дорогостоящим и редко используется для полуохимических систем доставки. С другой стороны, недорогие полиэтиленовые блистерные упаковки, известные как пузырьковые крышки, имеют намного большие емкости и предлагают более выгодное соотношение площади поверхности к объему. Пузырьковые колпачки надежно доставляют многие полухимикаты и сделали использование химикатов-репеллентов практичным и доступным. Например, сотни тысяч 3-метил-2-циклогексеноновых пузырьковых крышек ежегодно используются в Северной Америке в качестве антиагрегационного феромона для защиты деревьев пихты Дуглас от нападения жука Дуглас-пихта ( Dendroctonus pseudotsugae Hopkins; Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) ( Вакарчук, неопубликованные данные). Пузырьковые колпачки могут быть приспособлены для продолжительного использования в полевых условиях, выбирая из множества мембран, которые также могут помочь в экранировании ультрафиолетового излучения и увеличении количества стабилизаторов, добавляемых в семиохимический резервуар. В настоящей работе пузырьковые колпачки все еще были активны через 19 недель после установки, что аналогично другим приманкам из сесквитерпеновых пузырьков, развернутым во Флориде ( Кендра и соавт. 2016 ). Срок годности пузырьковых крышек в морозильных условиях стабильный; часто год и более хранения не наносят ущерба продукту (Вакарчук, неопубликованные данные). Эти свойства делают систему с пузырьковой крышкой очень привлекательной для экономичной доставки потенциального репеллента для ягодного кофейного ящика. Развертывание на месте эффективного репеллента для ягодных кофейных зерен может стать стратегией борьбы с вредителями, которая не потребует сочетания с другими тактиками, чтобы эффективно снижать уровни заражения и, следовательно, увеличивать урожайность.

Одновременное использование аттрактантов и репеллентов для ягодных кофейных зерен Hassanali et al. 2008 , Хан и соавт. 2011 , Лопес и соавт. 2013 , Нихия и соавт. 2014 ) заслуживает детального изучения кофейных плантаций. В 3-недельном полевом эксперименте на кенийской кофейной плантации антигрегационный феромон фронталин Dendroctonus был показан Njihia и соавт. (2014) действовать «как в качестве репеллента, так и в качестве ингибитора аттрактантов H. hampei» . Ловушки, содержащие аттрактант метанол: этанол (1: 1) и фронталин, имели уловления захвата на 77% ниже, чем когда аттрактант использовался сам по себе (4,44 ± 1,32 против 19,00 ± 4,29 соответственно). В отличие от настоящего исследования, в котором ( E, E ) -α-фарнезен все еще был активен в течение 19 недель после размещения на местах, все химические вещества, использованные в полевом исследовании в Кении, заменялись еженедельно ( Njihia и соавт. 2014 ).

Несмотря на то, что использование растительных репеллентов на полях для кофейных ягод в основном остается неисследованным, работа Pohlan (2005) а также Pohlan et al. (2008) предполагает, что Canavalia ensiformis (Leguminosae) может иметь отталкивающие свойства кофейных ягод на кофейных плантациях в Мексике. Возможное использование репеллентных растений на кофейных плантациях требует дальнейшего изучения.

В заключение следует отметить, что использование составов ( E , E ) -α-фарнезена с пузырьковыми крышками с длительным полевым сроком службы, которые производители могут легко устанавливать на кофейных ветвях, может стать надежной и простой в применении стратегией борьбы с вредителями против бури-ягодника кофе. ,